NABOCUL®: от химии рожкового дерева к новым молекулам косметической биохимии

Международное исследование Ceratonia siliqua L., открытие новых природных соединений и развитие технологии Olandu®

Современная косметическая разработка начинается задолго до создания крема или сыворотки. Ей предшествуют поиск перспективного природного сырья, разделение сложного экстракта на индивидуальные соединения, установление их молекулярной структуры и последовательная оценка биологической активности.

Именно такой исследовательский путь лежит в основе международной работы по изучению плодов рожкового дерева — Ceratonia siliqua L. Проект объединил специалистов в области фармакогнозии, химии природных соединений, спектроскопического анализа и биологического скрининга. Среди аффилиаций авторов указано косметическое подразделение Nabocul Cosmetics Company Limited в Токио, а также научные структуры Китая.

Результаты были опубликованы в рецензируемом журнале Natural Product Research. Исследователи выделили из стручков рожкового дерева двенадцать индивидуальных веществ, включая два ранее не описанных фенилпропаноида и один новый изофлавоновый гликозид. Структуры соединений были установлены с применением одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии, UV- и IR-спектроскопии и высокоразрешающей масс-спектрометрии. Все выделенные вещества дополнительно исследовали in vitro на способность ингибировать ацетилхолинэстеразу.

Эта публикация представляет собой не рекламное описание растительного экстракта, а фундаментальную химическую работу: от природного сырья — к индивидуальной молекуле, от молекулы — к установленной структуре, от структуры — к первичной экспериментальной оценке.

Рожковое дерево: средиземноморское растение с необычайно сложным химическим профилем

Рожковое дерево относится к семейству бобовых. Это вечнозелёное, устойчивое к засушливым условиям растение, традиционно культивируемое в Средиземноморском регионе. Его плоды представляют собой крупные стручки, состоящие из мякоти и семян.

В пищевой промышленности мякоть рожкового дерева известна как источник природных сахаров, клетчатки и ароматических веществ. Семена используются для получения камеди рожкового дерева. Однако с точки зрения биохимии растение представляет интерес прежде всего как сложная природная библиотека вторичных метаболитов.

В разных частях Ceratonia siliqua обнаружены:

фенольные кислоты;
галлотанины и проантоцианидины;
флавонолы и их гликозиды;
катехины;
фенилпропаноиды;
изофлавоновые соединения;
органические кислоты;
циклические спирты;
полисахариды и другие классы природных веществ.

Химический профиль рожкового дерева непостоянен. Он зависит от сорта, географического происхождения, климатических условий, зрелости плодов, способа сушки, обжаривания, хранения и технологии экстракции. Метаболомное исследование плодов показало, что происхождение сырья, степень созревания и термическая обработка способны существенно менять состав низкомолекулярных соединений.

Именно поэтому общее название растения ещё ничего не говорит о свойствах конкретного косметического ингредиента. Для научной разработки необходимо знать, какая часть растения использована, каким способом получен экстракт, какие вещества в нём присутствуют и в какой концентрации.

Почему недостаточно сказать: «экстракт рожкового дерева»

Растительный экстракт представляет собой смесь десятков или сотен веществ. Некоторые из них присутствуют в значительном количестве, другие — в следовых концентрациях. Часть соединений может быть стабильной, часть разрушается под действием света, кислорода, температуры или изменения pH.

Поэтому научно ориентированный подход предполагает несколько уровней работы:

получение экстракта;
его фракционирование;
разделение фракций хроматографическими методами;
выделение индивидуальных соединений;
установление молекулярной формулы;
определение химической структуры;
сравнение с уже известными веществами;
проверку биологической активности;
изучение стабильности и безопасности;
разработку готовой косметической формы.

Работа с участием NABOCUL® была сосредоточена на одном из самых фундаментальных этапов — выделении и точной идентификации природных молекул.

Что именно было обнаружено

Из стручков Ceratonia siliqua L. исследователи выделили двенадцать соединений:

два новых фенилпропаноида;
один новый изофлавоновый гликозид;
девять ранее известных природных веществ.

В научной публикации новые вещества обозначены номерами 1, 2 и 3. Остальные соединения получили номера от 4 до 12.

Термин «новое соединение» имеет здесь строгое значение: речь идёт о химической структуре, которая ранее не была описана в доступной научной литературе.

Это значительно серьёзнее, чем обнаружение уже известного полифенола в новом растительном источнике. Для признания соединения новым требуется:

выделить его в достаточно чистом виде;
определить молекулярную массу;
установить элементный состав;
определить взаимное расположение атомов;
доказать строение углеводного фрагмента, если речь идёт о гликозиде;
сопоставить данные с научными базами и публикациями;
исключить совпадение с ранее описанными структурами.

Фенилпропаноиды: молекулярная система адаптации растений

Фенилпропаноиды — обширный класс вторичных метаболитов растений, формирующихся преимущественно из аминокислоты фенилаланина через фенилпропаноидный биосинтетический путь.

Эти соединения помогают растению взаимодействовать с окружающей средой. Они участвуют в:

адаптации к ультрафиолетовому излучению;
защите от окислительного стресса;
реакции на механическое повреждение;
формировании клеточных стенок;
взаимодействии с микроорганизмами;
образовании пигментов;
синтезе ароматических веществ;
регуляции роста и развития.

К этому метаболическому направлению относятся фенольные кислоты, флавоноиды, лигнаны, кумарины и многочисленные промежуточные соединения.

Для косметической науки фенилпропаноиды интересны из-за структурного разнообразия. Даже небольшое изменение положения гидроксильной группы, углеводного остатка или двойной связи может изменить:

растворимость;
способность связывать свободные радикалы;
устойчивость к окислению;
взаимодействие с ферментами;
проникновение в биологические мембраны;
фотостабильность;
токсикологический профиль.

Поэтому принадлежность молекулы к классу полифенолов ещё не является доказательством косметического эффекта. Значение имеет точная структура конкретного соединения.

Изофлавоновый гликозид: почему углеводный фрагмент меняет свойства молекулы

Изофлавоны представляют собой особую группу полифенольных соединений. В растении они могут находиться как в свободной форме, так и в форме гликозидов — соединений, в которых полифенольная часть связана с молекулой сахара.

Гликозилирование способно существенно изменить физико-химические свойства вещества:

увеличить его гидрофильность;
изменить растворимость в воде;
повлиять на химическую стабильность;
изменить взаимодействие с ферментами;
повлиять на распределение в биологических средах;
изменить способность проходить через мембраны;
повлиять на доступность агликоновой части.

Поэтому новый изофлавоновый гликозид представляет интерес не только как новая запись в каталоге природных соединений. Он создаёт основу для изучения связи между молекулярной структурой, растворимостью и биологическим поведением.

Как доказывают структуру неизвестной природной молекулы

Идентификация нового соединения требует совокупности аналитических методов. В исследовании применялись 1D- и 2D-ЯМР, UV-, IR-спектроскопия и высокоразрешающая масс-спектрометрия.

Высокоразрешающая масс-спектрометрия — HRESIMS

Масс-спектрометрия высокого разрешения позволяет с высокой точностью определить отношение массы и заряда иона. На основании этих данных исследователи рассчитывают вероятный элементный состав молекулы.

Метод помогает ответить на вопросы:

сколько атомов углерода, водорода и кислорода входит в соединение;
какова его точная молекулярная масса;
какие фрагменты образуются при ионизации;
соответствует ли предполагаемая формула экспериментальному спектру.

Одномерная ЯМР-спектроскопия

¹H-ЯМР показывает химическое окружение атомов водорода, а ¹³C-ЯМР — окружение атомов углерода.

По положению и форме сигналов можно судить о наличии:

ароматических колец;
метоксильных групп;
гидроксильных заместителей;
двойных связей;
углеводных фрагментов;
карбонильных групп.

Двумерная ЯМР-спектроскопия

Двумерные методы дают информацию о связях между отдельными атомами и фрагментами молекулы.

Они позволяют установить:

какие протоны связаны друг с другом;
какой атом водорода находится рядом с определённым атомом углерода;
через сколько химических связей взаимодействуют атомы;
в какой позиции к основной структуре присоединён углеводный остаток;
как соединены отдельные структурные блоки.

Ультрафиолетовая спектроскопия

UV-спектр характеризует электронные переходы в хромофорных системах. Для полифенолов он помогает подтвердить наличие ароматических и сопряжённых фрагментов.

Инфракрасная спектроскопия

IR-спектроскопия позволяет выявлять характерные функциональные группы:

гидроксильные;
карбонильные;
эфирные;
ароматические;
углеводные.

Ни один из этих методов по отдельности обычно не даёт полного ответа. Структура нового природного соединения устанавливается путём сопоставления всех экспериментальных данных.

Научная публикация: проверяемый результат международной работы

Статья была опубликована в Natural Product Research, том 37, выпуск 20, страницы 3395–3401. Электронная версия появилась 14 мая 2022 года, а библиографически работа вошла в выпуск журнала за 2023 год. DOI публикации: 10.1080/14786419.2022.2076230.

Авторы работы:

Zhi-Tian Peng;
Ying-Jie Xia;
Takuya Yashiro;
Xiong Gao;
Tina Ting-Xia Dong;
Karl Wah-Keung Tsim;
Huai-You Wang.

Университетский исследовательский портал Hong Kong University of Science and Technology классифицирует работу как рецензируемую журнальную публикацию.

Особенно важно, что в составе аффилиаций, приведённых в материалах исследования, присутствует Cosmetic Division, Nabocul Cosmetics Company Limited, Tokyo, Japan.

Это свидетельствует об участии косметической компании не только на этапе коммерциализации готовой формулы, но и на уровне фундаментального исследования природных соединений.

Зачем исследовать ацетилхолинэстеразу

Все двенадцать выделенных соединений были протестированы in vitro на способность ингибировать ацетилхолинэстеразу — AChE.

Ацетилхолинэстераза — фермент, расщепляющий ацетилхолин. Наиболее известна её роль в нервной системе, где она завершает действие ацетилхолина в синаптической щели.

Однако ацетилхолин существует не только как нейромедиатор. Ненейрональная холинергическая система обнаружена в эпителиальных, эндотелиальных, иммунных и других клетках. В коже ацетилхолин синтезируется и метаболизируется кератиноцитами, эндотелиальными и иммунокомпетентными клетками; холинергическая сигнализация участвует в межклеточной коммуникации и регуляции отдельных функций эпидермиса.

Это делает ферменты холинергического обмена интересными молекулярными мишенями для фундаментального скрининга.

Но между ингибированием очищенного фермента в пробирке и эффектом косметического продукта на коже существует значительная дистанция. Результат ферментативного теста не означает автоматически, что соединение:

проникает через роговой слой;
достигает клеток-мишеней;
сохраняется в активной форме;
изменяет состояние кожи;
влияет на мимические мышцы;
уменьшает морщины;
обладает терапевтическим действием.

Что означает показатель IC₅₀

В исследовании соединения 4, 5 и 12 продемонстрировали ингибирующую активность в отношении AChE с IC₅₀ от 15,0 до 50,2 мкмоль/л.

IC₅₀ — концентрация исследуемого вещества, при которой активность фермента в конкретной экспериментальной системе уменьшается приблизительно на 50%.

Этот показатель позволяет:

сравнивать вещества в рамках одного лабораторного теста;
оценивать зависимость эффекта от концентрации;
отбирать молекулы для дальнейшего изучения;
формировать гипотезы о связи структуры и активности.

Но IC₅₀ не является:

дозировкой косметического продукта;
показателем эффективности на человеке;
гарантией проникновения через кожу;
характеристикой безопасности;
клинической рекомендацией.

Особенно важно, что AChE-активность показали соединения 4, 5 и 12 — то есть известные вещества, а не три вновь описанные молекулы. Новизна химической структуры и наибольшая активность в выбранном тесте — разные научные параметры.

Другие исследования холинэстеразной активности рожкового дерева

Ранее водные отвары различных частей Ceratonia siliqua — листьев, мякоти, муки из зародышей, камеди и коры — также исследовали in vitro в отношении ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы. Эти работы подтверждают, что холинэстеразный скрининг рожкового дерева является самостоятельным направлением фитохимических исследований.

В другой лабораторной работе метанольный экстракт Ceratonia siliqua оценивали в моделях гликирования белков и ингибирования ацетилхолинэстеразы.

Более поздние исследования листьев рожкового дерева также обнаружили соединения с измеряемой антихолинэстеразной активностью, однако эти результаты относятся к другому растительному материалу, другим экстрактам и другим единицам концентрации. Их нельзя напрямую переносить на стручки или отдельные молекулы из публикации NABOCUL®.

Совокупность данных показывает, что Ceratonia siliqua содержит несколько химических классов, способных взаимодействовать с ферментами в лабораторных моделях. Но она не доказывает эффективность готового косметического продукта.

Полифенольный профиль стручков рожкового дерева

Плоды рожкового дерева широко исследуются как источник фенольных соединений.

В различных образцах обнаруживались:

галловая кислота;
протокатеховая кислота;
катехин;
эпикатехин;
кверцетиновые гликозиды;
рутин;
галлотанины;
проантоцианидины.

Исследование анатолийских образцов показало присутствие фенольных кислот, флаванолов и танинов; галловая кислота была обнаружена в свободной, эфирной и гликозидной фракциях.

Хроматографическое исследование продуктов из рожкового дерева также выявило значительную вариабельность содержания фенолов между мякотью, порошком и сиропом. В ряде образцов среди наиболее заметных компонентов находились галловая кислота и рутин.

Извлечение полифенолов зависит и от растворителя: разные экстракционные системы выделяют разные группы веществ и дают неодинаковый общий фенольный профиль.

Для косметической разработки это принципиально. Два ингредиента с одинаковой надписью «экстракт рожкового дерева» могут существенно различаться по составу и активности.

Антиоксидантные данные: что они означают и чего не доказывают

Для экстрактов стручков рожкового дерева неоднократно показывали антиоксидантную активность в лабораторных тестах. В гидроэтанольных экстрактах обнаруживались полифенольные соединения, способные участвовать в реакциях нейтрализации свободных радикалов или восстановления окисленных реагентов.

Однако термин «антиоксидантная активность» объединяет разные методы:

DPPH;
ABTS;
FRAP;
ORAC;
определение восстановительной способности;
клеточные модели окислительного стресса.

Каждый тест оценивает отдельный химический механизм. Высокая активность экстракта в растворе не гарантирует:

стабильности в косметической формуле;
проникновения в кожу;
сохранения активности после нанесения;
клинического уменьшения признаков фотостарения;
защиты кожи от ультрафиолета;
противовоспалительного действия.

Поэтому антиоксидантный тест является одним из этапов исследования, но не эквивалентом клинической эффективности.

Почему рожковое дерево интересно для косметической биохимии

Научный потенциал Ceratonia siliqua связан не с одним «главным» компонентом, а с сочетанием нескольких особенностей.

Химическое разнообразие

Плоды содержат фенольные кислоты, флавоноиды, танины, фенилпропаноиды и гликозиды.

Возможность структурных открытий

Исследование с участием NABOCUL® показало, что даже хорошо известное пищевое растение может содержать ранее не описанные молекулы.

Вариативность свойств

Различия в структуре соединений позволяют изучать взаимосвязь между молекулярным строением, растворимостью, ферментативной активностью и стабильностью.

Технологическая перспективность

Гликозилированные полифенолы могут обладать иной водорастворимостью и технологическим поведением по сравнению со свободными агликонами.

Возможность стандартизации

После обнаружения маркерной молекулы можно разработать аналитический метод, контролировать её содержание в сырье и перейти от неопределённого растительного экстракта к воспроизводимому ингредиенту.

От научной публикации к запатентованной разработке

Работа по идентификации соединений из стручков стала частью более широкого исследовательского направления NABOCUL Cosmetics.

В официальных материалах компании новое низкомолекулярное соединение, выделенное из стручков средиземноморского рожкового дерева, получило название Olandu®. Производитель приводит молекулярную формулу C₂₃H₂₄O₁₃ и связывает разработку с японским патентом № 6976014.

Компания также указывает публикацию в Natural Product Research среди научных источников, относящихся к этапу обнаружения и изучения соединений из Ceratonia siliqua.

Таким образом, можно проследить последовательную исследовательскую линию:

выбор природного источника;
разделение экстракта;
выделение индивидуальных молекул;
спектроскопическая идентификация;
научная публикация;
патентная защита;
последующая разработка косметического ингредиента;
создание продуктов на его основе.

При этом научная статья 2023 года и последующие сведения компании об Olandu® необходимо различать.

Рецензируемая публикация подтверждает выделение и установление структуры новых соединений, а также результаты AChE-теста. Данные о влиянии Olandu® на экспрессию генов коллагена приводятся производителем в отдельных материалах и не являются результатом описанного AChE-исследования.

Olandu® и исследования COL1A1: отдельный уровень доказательств

NABOCUL Cosmetics сообщает, что Olandu® представляет собой низкомолекулярное соединение, выделенное из стручков рожкового дерева. В материалах производителя заявлены исследования его влияния на экспрессию COL1A1 — гена, кодирующего α1-цепь коллагена I типа.

На официальной странице приводятся результаты клеточного или лабораторного тестирования, в котором использование компонента сопровождалось повышением экспрессии COL1A1. В разных публикациях компании фигурируют показатели около 274–300% в течение 24 часов, что, вероятно, связано с различными сериями исследований или способами представления результатов.

Эти сведения необходимо интерпретировать строго:

повышение экспрессии гена в экспериментальной модели не равно клиническому увеличению плотности дермы;
увеличение уровня mRNA не всегда пропорционально количеству зрелого функционального коллагена;
клеточный результат не позволяет автоматически предсказывать эффект готового косметического средства;
значение имеют концентрация, система доставки, стабильность и фактическая доступность соединения в коже;
клинические выводы требуют исследования готового продукта на добровольцах.

Поэтому для научного сайта корректна следующая формулировка:

По данным производителя, последующие экспериментальные исследования запатентованного соединения Olandu®, выделенного из стручков Ceratonia siliqua, продемонстрировали влияние на экспрессию COL1A1 в лабораторной модели. Эти данные относятся к исследованному ингредиенту и не эквивалентны клиническому исследованию готового косметического продукта.

Почему коллаген I типа оказался в центре последующей разработки

Коллаген I типа является одним из основных структурных белков дермы. Он формирует волокнистую матрицу, которая участвует в поддержании механической прочности кожи.

С возрастом и под воздействием ультрафиолета меняются:

синтез коллагена;
организация волокон;
активность матриксных металлопротеиназ;
сигнальные пути фибробластов;
структура внеклеточного матрикса.

Наружное нанесение крупной молекулы нативного коллагена в основном оказывает поверхностное увлажняющее и плёнообразующее действие: молекулярная масса полноценного коллагена слишком велика для свободного проникновения через неповреждённый роговой слой.

Поэтому современный исследовательский интерес смещается от идеи «доставить готовый коллаген» к поиску низкомолекулярных соединений, способных взаимодействовать с клеточными сигнальными путями.

Именно к этому направлению NABOCUL® относит разработку Olandu®.

Патент и научная статья: почему это разные формы доказательств

Научная публикация проходит рецензирование и представляет экспериментальные результаты в форме, позволяющей специалистам оценить методику и выводы.

Патент решает другую задачу: он закрепляет правовую охрану технического решения, если оно соответствует критериям новизны, изобретательского уровня и промышленной применимости.

Наличие патента подтверждает:

существование заявленного технического решения;
прохождение патентной экспертизы;
юридически оформленную новизну в пределах патентных притязаний.

Но патент сам по себе не является:

клиническим исследованием;
медицинским одобрением;
доказательством эффективности готового средства;
независимой оценкой косметического результата.

Сильная исследовательская позиция возникает тогда, когда патентная защита сочетается с аналитическими данными, научной публикацией, экспериментами на релевантных моделях и последующим исследованием готовой формулы.

Значение международного сотрудничества

Состав авторов публикации показывает участие специалистов из разных исследовательских сред.

Такая кооперация имеет практическое значение, потому что изучение природного вещества требует компетенций сразу в нескольких областях:

ботанической идентификации;
фармакогнозии;
экстракционной химии;
хроматографии;
спектроскопии;
масс-спектрометрии;
ферментологии;
клеточной биологии;
косметической технологии.

Участие косметического подразделения NABOCUL® в подобной работе отличает исследовательскую модель компании от простой закупки готового растительного экстракта у стороннего поставщика.

В этой модели природное сырьё становится объектом самостоятельного молекулярного исследования.

От этноботаники к точной косметической науке

В традиционном подходе растения часто описывают через широкие категории: «антиоксидантное», «омолаживающее», «успокаивающее».

Научный подход требует другого языка:

какое конкретно соединение выделено;
какова его молекулярная формула;
как установлена структура;
в каком тесте проявлена активность;
какова эффективная концентрация;
на какой модели получен результат;
подтверждён ли механизм;
исследована ли безопасность;
проверена ли готовая формула.

Исследование рожкового дерева демонстрирует именно такой переход — от общего растительного образа к точной молекулярной характеристике.

Что подтверждено наиболее надёжно

На основании рецензируемой публикации можно утверждать следующее:

из стручков Ceratonia siliqua L. выделены двенадцать индивидуальных соединений;
два из них классифицированы как новые фенилпропаноиды;
одно — как новый изофлавоновый гликозид;
структуры установлены с использованием 1D- и 2D-ЯМР, UV-, IR- и HRESIMS;
все соединения исследованы in vitro на ингибирование AChE;
соединения 4, 5 и 12 показали активность с IC₅₀ 15,0–50,2 мкмоль/л;
работа опубликована в рецензируемом журнале Natural Product Research;
среди аффилиаций указано косметическое подразделение Nabocul Cosmetics Company Limited.

На основании официальных материалов NABOCUL Cosmetics можно дополнительно утверждать:

компания продолжила исследования соединений из рожкового дерева;
один из разработанных компонентов получил название Olandu®;
производитель связывает его с японским патентом № 6976014;
для ингредиента проводились отдельные экспериментальные исследования экспрессии COL1A1.

Что пока нельзя утверждать без дополнительных данных

Опубликованное исследование не подтверждает, что:

все экстракты рожкового дерева обладают одинаковыми свойствами;
новые соединения клинически омолаживают кожу;
AChE-активность приводит к уменьшению морщин;
вещества проникают в дерму при наружном нанесении;
соединения безопасны в любой концентрации;
готовые средства NABOCUL® прошли клиническое испытание в рамках этой публикации;
повышение экспрессии COL1A1 автоматически означает долговременное увеличение плотности кожи;
результаты одного ингредиента распространяются на всю линейку продукции.

Такое разграничение усиливает, а не ослабляет научную позицию. Оно показывает, где заканчиваются установленные данные и начинается область дальнейших исследований.

Заключение

Международная работа по изучению стручков рожкового дерева с участием Cosmetic Division Nabocul Cosmetics Company Limited представляет собой пример фундаментального подхода к созданию косметических разработок.

В ходе исследования:

природный экстракт был разделён на индивидуальные соединения;
обнаружены три ранее не описанные молекулы;
их структуры установлены комплексом современных спектроскопических методов;
проведён первичный биологический скрининг;
результаты опубликованы в рецензируемом международном журнале;
дальнейшая работа компании была продолжена на уровне патентования и разработки Olandu®.

Главная ценность проекта заключается не в попытке назвать рожковое дерево очередным «чудо-растением». Она состоит в переходе от растительного сырья к точной молекулярной науке.

Исследовательская модель NABOCUL® строится как последовательность: природный источник → выделение вещества → установление структуры → экспериментальная оценка → патентная разработка → косметическая формула.

Именно такая последовательность превращает растительный компонент из маркетингового образа в объект проверяемой косметической биохимии.

Научные источники

Peng Z.-T., Xia Y.-J., Yashiro T., Gao X., Dong T.T.-X., Tsim K.W.-K., Wang H.-Y. Novel phenylpropanoids and isoflavone glycoside are isolated and identified from the carob pods (Ceratonia siliqua L.). Natural Product Research. 2023;37(20):3395–3401. DOI: 10.1080/14786419.2022.2076230.
Custódio L. et al. In vitro antioxidant and inhibitory activity of water decoctions of carob tree on cholinesterases, α-amylase and α-glucosidase.
Ayaz F.A. et al. Исследование сахаров, органических кислот, минералов и фенольных соединений стручков рожкового дерева.
Ioannou G.D. et al. Исследование фенольного профиля и антиоксидантной активности продуктов из рожкового дерева.
Kurzen H. et al. The non-neuronal cholinergic system of human skin.
Qu H.Q. et al. Implications of the non-neuronal cholinergic system for skin physiology and diseases.
Официальные материалы Nabocul Cosmetics об открытии и разработке Olandu®.